采血卡（干血斑DBS）的应用及潜力（下）

1、收集和储存血液标本：

在韩国大田Eulji大学医院测试的未受影响的个体的EDTA管中收集血样。 所有血液样品均以年轻成人（20-40岁）作为EDTA全血和采血卡干血斑（DBS）样品获得。

将采血卡干血斑（DBS）样品（各40μL）点在Whatman FTA卡（Whatman Inc.，Brentford，UK）上，并在室温下干燥24小时。 将它们在室温或-80℃下储存直至分析，然后在单独的清洁拉链袋中保持2,4周和3个月。液体，EDTA处理的血液样品也在80℃下储存2,4周和3个月。

2、 从采血卡干血斑（DBS）中提取DNA：

对于单链DNA（ssDNA）提取，将卡上的采血卡DBS用剪dao切成小块并转移到已加入500μLdH2 O的1.5-mL微管中; 将管在室温下保持5分钟。 弃去dH 2 O，重复该过程两次。 将滤纸浸泡在500μL提取缓冲液[磷酸盐缓冲盐水（PBS）或10mM Tris-EDTA（TE）]中。

对于裂解，将红细胞裂解缓冲液（100μL）加入滤纸中，然后将其与10μL（1mg / mL）蛋白酶K在37℃下孵育过夜。 在血细胞裂解后，用干净的移液管尖端将滤纸压在管底部几次 。 为了提高提取效率，将细胞裂解物在95℃温育15分钟。 短暂离心（2-3秒）后除去滤纸，将含有DNA的上清液保存在-80℃直至分析。

对于双链DNA（dsDNA）提取，将已经冲压的每个滤纸样品浸泡在40μLTris-EDTA缓冲液或PBS中，并在37℃下孵育过夜。 使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，USA）按照制造商的说明从血液中分离基因组DNA。

 3、DNA浓度：

通过测量260nm处的吸光度（ A 260 ）来确定DNA浓度，并假设A 260为1.0等于50ng /μL纯dsDNA或35ng /μL纯ssDNA。 使用SmartSpec plus分光光度计（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测量提取的DNA的浓度。

 4、聚合酶链反应：

GAPDH和β-肌动蛋白转录物的水平用于验证提取的DNA的质量。 对于GAPDH PCR，PCR反应混合物含有3μL提取的DNA，10pmol的每种引物和Bioneer PCR预混物，终体积为20μL。 热循环在CFX96 Touch系统（Bio-Rad）中进行，具有以下用于GAPDH的PCR程序：在94℃下初始变性8分钟; 然后进行40个循环，94℃1分钟，65℃1分钟，72℃1分钟; 结束时在72°C下7分钟，在4°C下1分钟。 除退火温度为64℃外，类似的PCR程序用于β-肌动蛋白PCR 。

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