DNA采血卡提取与放大WGA协议（下）

DNA采血卡样品放大

在上一步的15L反应中添加以下试剂：

7.5升10倍放大主混合
47.5升无核水
5.0L启动™TaqDNA聚合酶(12.5单位)用于WGA 1
-或-
5.0L WGA DNA聚合酶用于WGA 2

混合，离心，并开始热循环：
初始变性：95℃，3分钟
执行以下14个周期：
变性：95℃，15秒
退火/延伸：65℃，5分钟

循环完成后，将反应保持在4°C，或储存在-20°C，直到准备好进行分析或净化。

再放大

1.在PCR管或多孔板中加入10μg/L的1 ng/L WGA扩增DNA。
注：为了减少再放大过程中可能出现的偏置，必须清 除WGA反应。我们推荐使用Genelute™聚合酶链反应清洁套件(产品编号)。NA 1020)或分离单链和双链DNA的标准纯化方法。

2.创造放大组合。对于每一次再扩增反应，在WGA扩增DNA中添加以下内容(步骤1)：

47.5升核心酶-无水
7.5升10倍放大主混合
5种WGA DNA聚合酶

3.旋涡彻底，离心机短暂，并开始热循环。已为PE 9700或等效的热循环器优化了下列配置文件：
初始变性95°C 3分钟，执行以下14个循环：
变性94°C 15秒
退火/延长65°C 5分钟

循环完成后，将反应保持在4°C，或储存在-20°C，直到准备好进行分析或净化。WGA DNA的稳定性相当于在相同条件下保存的基因组DNA。

净化

用GenElute™PCR清洁试剂盒纯化扩增产物(NA 1020)

1.插入一个GenElute™迷你预装订柱(带有蓝色O形环)到提供的收集管中，如果还没有组装好的话。在每个微柱上加入0.5mL的柱制剂液，在12，000×g离心30秒至1分钟。丢弃洗脱液。

注：柱制备液较大限度地将DNA与膜结合，从而使产率更加一致。

2.在1份PCR反应中加入5份结合液，然后混合。例如，在PCR反应的100微升中加入500微升的结合液。. 将解决方案传输到绑定列中。以较大速度(12，000至16，000 x g)离心1分钟。抛弃洗脱液，保留收集管。

3.将绑定列替换到收集管中。在柱上加入0.5mL稀释后的洗液，以较大速度离心1分钟。抛弃洗脱液，保留收集管。

注：一定要在第 一次使用前将乙醇加入洗液中。见采血卡准备说明。

4.将列替换到收集管中。以较大速度离心2分钟，无需任何额外的洗涤液，以去除多余的乙醇。丢弃任何残留的洗脱液以及收集管。

5.将柱转移到一个新鲜的2mL收集管。将50升的洗脱液或水涂在每个柱的中 心。室温孵育1分钟。
注：用水洗脱时，要确保水的pH值在5.5到8.5之间。也可以用10倍水稀释的洗脱液进行洗脱.

6.为了逃避DNA，以较大速度离心1分钟。PCR扩增产物现在存在于洗脱液中，可在-20°C下立即使用或储存。

扩增产物的量化

利用™全基因组扩增技术扩增的DNA量，无论纯化与否，都能被检测到。对于质量较高的DNA采血卡样品，强烈建议在扩增后进行纯化。放大产物可以用PicoGreen来测量。®双链DNA定量分析来自分子探针公司。(#P-7589)。另一种检测扩增产物的方法是在纳米滴上分光度法(OD 260)。®分光度计该仪器可在较大的动态范围内测量1μL样品的吸光度，范围为2~3700 ng/μL。